Apa itu reaksi berantai polimerase (pcr)? fakta tentang tes, langkah & digunakan untuk

Apa itu PCR (reaksi berantai polimerase)?

Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik yang digunakan untuk memperkuat jumlah jejak DNA (dan dalam beberapa kasus, RNA) yang terletak di atau pada hampir semua cairan atau permukaan di mana helai DNA dapat disimpan. Kunci untuk memahami PCR adalah mengetahui bahwa setiap manusia, hewan, tumbuhan, parasit, bakteri, atau virus mengandung bahan genetik seperti sekuens DNA (atau RNA) (sekuens nukleotida atau keping DNA atau RNA) yang unik untuk spesies mereka, dan kepada anggota individu spesies itu. Akibatnya, jika sampel berisi segmen DNA atau RNA, PCR adalah metode yang digunakan untuk memperkuat (membuat banyak salinan yang lebih identik) dari urutan unik ini sehingga mereka dapat digunakan untuk menentukan dengan probabilitas sangat tinggi identitas sumber (suatu orang tertentu, hewan, atau organisme patogen) dari jejak DNA atau RNA yang ditemukan di atau pada hampir semua sampel bahan.

Namun, amplifikasi PCR hanya bagian dari tes identifikasi. Setelah amplifikasi dilakukan (lihat di bawah), segmen yang diperkuat perlu dibandingkan dengan segmen nukleotida lainnya dari sumber yang diketahui (misalnya, orang, hewan, atau organisme patogen tertentu). Perbandingan segmen unik ini sering dilakukan dengan menempatkan urutan nukleotida yang dihasilkan PCR di sebelah urutan nukleotida yang diketahui dari manusia, patogen, atau sumber lain dalam gel pemisah. Arus listrik dijalankan melalui gel dan berbagai sekuens nukleotida membentuk pita yang menyerupai "tangga" sesuai dengan muatan listrik dan ukuran molekulnya. Ini disebut elektroforesis gel. Pita atau "tangga" seperti langkah-langkah yang bermigrasi ke tingkat yang sama dalam gel menunjukkan identitas urutan nukleotida. Metode ini adalah salah satu cara paling populer untuk menyelesaikan tes PCR (Lihat Gambar 1).

Gambar 1, Pita atau "tangga" seperti langkah-langkah PCR menghasilkan DNA Mycobacterium (milik CDC)

Angka. Elemen berulang (Rep) –PCR (A) dan pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (B) pola isolat Mycobacterium cosmeticum dari 2 pasien di Ohio dan 1 pasien di Venezuela. Rep-PCR dilakukan dengan menggunakan primer BOXA1R (3), dan PFGE dilakukan dengan enzim restriksi AseI. Jalur 1, 2, Ohio mengisolasi OH1 dan OH2; jalur 3, 4, galur kontrol ATCC BAA-878T dan ATCC BAA-879; jalur 5, isolat Venezuela VZ1. Standar ukuran DNA adalah 100-bp (S1) dan 48, 5-kb marker (S2).

Bagaimana PCR (reaksi berantai polimerase) dilakukan?

Pada tahun 1983, Kary Mullis menemukan langkah-langkah dasar untuk memperkuat urutan DNA. Dia dan Michael Smith dianugerahi Hadiah Nobel karena mengembangkan prosedur ini pada tahun 1993. Ada beberapa langkah dasar yang diikuti secara berurutan; PCR dapat dilakukan dalam satu tabung dengan bahan kimia yang sesuai dan pemanas yang dirancang khusus. Reagen atau bahan kimia yang dibutuhkan adalah sebagai berikut:

• Sampel yang mengandung urutan nukleotida (dari darah, rambut, nanah, kerokan kulit, dll.)
• Primer DNA: DNA untai tunggal pendek yang melekat pada sekuens nukleotida yang mendorong sintesis untai komplementer nukleotida
• DNA polimerase: enzim yang, ketika DNA memiliki ikatan primer, turun ke segmen DNA yang menempelkan blok bangunan DNA untuk membentuk pasangan basa komplementer dan dengan demikian mensintesis untai nukleotida komplementer DNA (pengenalan DNA polimerase tahan panas, Taq polimerase, yang berasal dari bakteri tahan panas, secara nyata meningkatkan kemampuan untuk melakukan PCR)
• Sejumlah besar blok bangunan DNA yang disebut nukleotida (Adenin, Timidin, Sitosin, dan Guanin, masing-masing disingkat sebagai: A, T, C, dan G) hadir dalam larutan. Ketika blok-blok ini dihubungkan bersama, mereka membentuk urutan nukleotida atau untai tunggal DNA. Ketika blok bangunan ini mengikat blok bangunan pelengkap mereka dengan ikatan hidrogen yang lemah (misalnya, A hanya akan mengikat dengan T dan G hanya dengan C), sekuens nukleotida DNA komplementer terbentuk dan terikat pada DNA untai tunggal asli. Ketika pengikatan selesai, DNA untai ganda komplementer dibentuk dalam urutan tertentu.

PCR, kemudian, dimulai dengan segmen DNA dari sampel yang ditempatkan dalam tabung dengan reagen yang terdaftar di atas. Solusinya dipanaskan setidaknya 94 C (201, 2 F); panas ini memecah ikatan hidrogen yang memungkinkan untai DNA komplementer terbentuk, jadi hanya untai tunggal yang ada dalam campuran (ini disebut denaturasi DNA untai ganda).

Campuran dibiarkan dingin hingga sekitar 54 C (129, 2 F). Pada suhu ini, primer DNA dan DNA polimerase berikatan dengan DNA beruntai tunggal individu (ini disebut anil DNA). Karena bahan penyusunnya berlebih (konsentrasi tinggi) dalam campuran, polimerase menggunakannya untuk membuat untaian DNA komplementer baru (disebut ekstensi DNA) dan proses ini lebih cepat pada 72 C (161, 6 F). Proses ini menciptakan molekul DNA untai ganda baru dari masing-masing untai tunggal dari molekul asli.

Siklus ini diulang sekitar 40 kali dalam mesin yang disebut pengendara sepeda termal yang secara otomatis mengulangi siklus pendinginan-pemanasan, dengan jumlah setiap urutan DNA yang berlipat dua setiap kali siklus pendinginan-pendinginan selesai. Apa yang awalnya adalah satu segmen pendek DNA dapat diamplifikasi menjadi sekitar 100 miliar kopi setelah 40 siklus berlipat ganda.

Mengapa seorang dokter memerintahkan tes PCR (polymerase chain reaction)?

Tes PCR membentuk dasar dari sejumlah tes yang dapat menjawab banyak pertanyaan medis berbeda yang membantu dokter mendiagnosis dan merawat pasien. Sebagai contoh, tes PCR dapat mendeteksi dan mengidentifikasi organisme patogen pada pasien, terutama yang sulit untuk dibudidayakan (misalnya, HIV dan virus lain dan jamur tertentu).

Dokter lain memesan tes PCR untuk membantu mendiagnosis penyakit genetik, sementara dokter lain menggunakan PCR untuk mendeteksi hubungan biologis seperti mengidentifikasi orang tua anak-anak. Tes PCR juga digunakan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi mutasi genetik dan pengaturan ulang yang ditemukan pada kanker tertentu.

Namun, tes PCR telah dimodifikasi dan diperluas ke banyak aspek penyelidikan ilmiah termasuk biologi evolusi, sidik jari genetik, penyelidikan forensik, dan banyak lainnya.

Apa itu RT-PCR?

RT-PCR adalah tes PCR yang dirancang untuk mendeteksi dan mengukur RNA. Meskipun tes PCR awal memperkuat DNA, banyak virus dan komponen biologis lainnya (misalnya, mitokondria) memanfaatkan RNA sebagai bahan genetiknya. RT-PCR berbeda dari PCR konvensional dengan terlebih dahulu mengambil RNA dan mengubah untai RNA menjadi untai DNA. Ini pada dasarnya dilakukan dengan metode yang sama untuk PCR yang dijelaskan di atas dengan pengecualian menggunakan enzim yang disebut reverse transcriptase alih-alih DNA polimerase. Reverse transcriptase memungkinkan satu untai RNA untuk diterjemahkan ke untai DNA komplementer. Setelah reaksi itu terjadi, metode PCR rutin kemudian dapat digunakan untuk memperkuat DNA. RT-PCR telah digunakan untuk mendeteksi dan mempelajari banyak virus RNA.

RT-PCR tidak harus bingung dengan variasi PCR lain, disebut PCR Waktu Nyata. PCR Waktu-Nyata adalah variasi PCR yang memungkinkan analisis DNA yang diamplifikasi selama 40 siklus prosedur yang biasa. Meskipun prosedur ini mirip dengan PCR konvensional dengan siklus, PCR Real-Time menggunakan pewarna fluoresen yang melekat pada beberapa blok bangunan atau untaian nukleotida kecil. Tergantung pada metode yang digunakan, fluoresensi terjadi ketika untaian DNA yang diperkuat terbentuk. Jumlah fluoresensi dapat diukur sepanjang 40 siklus dan memungkinkan para penyelidik untuk mengukur produk spesifik dan jumlahnya selama siklus amplifikasi. Ini sering memungkinkan penyelidik atau teknisi lab untuk melewatkan elektroforesis gel atau prosedur sekunder lainnya yang diperlukan untuk analisis produk PCR, sehingga menghasilkan hasil yang lebih cepat.

PCR dan RT-PCR Real-Time adalah variasi atau modifikasi dari tes PCR asli. Namun, ada lebih banyak variasi (setidaknya 25) yang ada dan digunakan untuk menyelesaikan masalah tertentu. Mereka semua memiliki nama yang berbeda seperti Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, PCR fase padat dan banyak lainnya.

PCR kemungkinan akan terus dimodifikasi untuk membantu menjawab pertanyaan lain dalam kedokteran, biologi. dan bidang studi lainnya.